JJF 1527-2015 聚合酶链反应分析仪校准规范（已发布实施）
1. 引言参考的相关标准：JJF 1030 - 2010 《恒温槽校准规范》SN/T 2102.1 - 2008 / ISO 22174： 2005《食源性病原体PCR检测技术规范 第1部分 ： 通用要求及定义》SN/T 2102.2 - 2008/ ISO 20836: 2005《食源性病原体PCR检测技术规范 第2部分： PCR性能试验要求》YY/T 1173 - 2010《聚合酶链反应分析仪》GB/T 6682 - 2008《分析实验室用水国家标准》首次发布2. 范围适用于模块加热的聚合酶链反应（ PCR ）分析仪计量性能的校准，对于其他类型的 PCR 仪，可参照本规范执行。3. 术语3.1 聚合酶链反应一种对特定的DNA或RNA片段在体外进行快速扩增的方法，由变性——退火——延伸三个基本反应步骤构成。PS：（90～95）℃变性；（40 ～60）℃退火；（70～75）℃延伸。不完全参照此温度。温度过高，会对酶活性有影响。因此，温度过冲不可太高。3.2 聚合酶链反应分析仪基于PCR技术原理，模拟DNA或RNA的复制过程，在模板、引物、聚合酶等存在的条件下，特异扩增已知序列，对其进行检测分析的仪器设备。4. 概述聚合酶链反应分析仪是基于PCR技术原理，模拟DNA或RNA的复制过程，在模板、引物、聚合酶等存在的条件下，特异扩增已知序列，对其进行检测分析的仪器设备，包括定性PCR仪和定量PCR仪两类。定性PCR通常由样品载台、热循环部件、控制部件和电源部件等部分组成。定量PCR仪主要由样品载台、热循环部件、控制部件、光学检测部件、电源部件、计算机及应用软件等部分组成。PS：目前PCR的分类可能有3种。①PCR ：即普通PCR，只有温度功能，无实时荧光定量功能。对应此规范提及的定性PCR②qPCR ： Quantitative Real-time PCR ，实时荧光定量PCR，对应此规范所提及的定量PCR（此规范的标物制备中，提及的也是加入荧光探针）③dPCR ： Digital PCR，数字PCR, 可直接输出DNA分子的个数，绝对定量。（目前在国家计量技术规范全文公告系统还没有查到数字PCR）5. 计量特性简单的说，如果定量的，就需要做样本相关的项目。来源至国家计量技术规范全文公开系统
6. 校准条件仪器使用允许的环境条件，测量过程中应测量和记录环境的温度、相对湿度。6.1 校准设备及标准物质6.1.1 温度校准装置由若干个（通常为15个）精密温度传感器、数据采集分析模块组成，测量范围（0-120）℃，温度校准装置测量不确定度≤0.1 ℃，且需要通过计量检定。6.1.2 标准物质校准时应采用国内外有证标准物质，包括：质粒DNA标准物质、核糖核酸标准物质，其特性量值（拷贝数≥10^910910^9109copies/μL），相对扩展不确定度≤5 %。6.1.3 电子天平精度≤0.01 mg，且需要通过计量检定。6.1.4 移液器规格：2 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL，且需要通过计量检定。校准前按照附录A配置校准时使用的溶液。7. 校准项目和校准方法7.1 校准条件校准前需将PCR仪开机预热30 min。7.2 温度示值误差、温度均匀性校准7.2.1 将PCR仪及温度校准装置各部件连接完好，在温度传感器表面上涂抹适量的导热油，按图1所示将温度传感器置于PCR仪（96孔）加热模块设定孔中，其他型号的PCR仪可参照图1进行测试。来源至国家计量技术规范全文公开系统
7.2.2 参照送校单位提供的PCR仪说明书设定温度控制程序，如表2所示，不能设定30 ℃为温控程序起点的PCR仪，温控程序参照表2进行设定。来源至国家计量技术规范全文公开系统
7.2.3 启动温度校准装置，记录整个数据采集过程并保存。7.2.4 温度示值误差校准结果按公式（1）和公式（2）计算：绝对误差来源至国家计量技术规范全文公开系统
7.2.5 温度均匀度校准结果按公式（3）计算：最大值 - 最小值来源至国家计量技术规范全文公开系统
7.3 升降温速率校准7.3.1 参照送校单位提供的PCR仪说明书设定该PCR仪的温度控制程序，如表3所示。启动温度校准装置，记录整个数据采集过程并保存。来源至国家计量技术规范全文公开系统
7.3.2 记录仪器显示温度达到设定温度恒温10 s后，取50 ℃温度点TA和90 ℃温度点TB，这中间的时间为t。来源至国家计量技术规范全文公开系统
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PS:在计算平均降温速率时，规范中所给出来的对应关系，存在了冲突的地方。即最终导致计算出来的速率是正的还是负的。7.4 定量PCR仪样本示值误差、样本线性的校准7.4.1 标准物质的配制详见附录A7.4.2 校准板的制备用经过计量校准的移液器，将配制好的PCR 反应体系加入到反应板中，按图所示准备96孔校准板，其他型号的仪器可参照本示例准备。来源至国家计量技术规范全文公开系统
PCR 反应体系的配制方法见附录B7.4.3 参照送校单位提供的PCR仪说明书设定该PCR仪的温度控制程序，如表4所示。来源至国家计量技术规范全文公开系统
7.4.4 分析参数的设置参照送校单位提供的PCR仪说明书设定PCR仪的数据分析参数。7.4.5 样本示值误差按绝对误差计算。来源至国家计量技术规范全文公开系统
PS：此项没有描述要取多少次测量值的平均值，但在附录E 校准原始记录参考格式中，里面体现的是10次测量值。来源至国家计量技术规范全文公开系统
7.4.6 样本线性以系列稀释的标准物质（至少5个）扩增Ct值与浓度对数值进行线性回归，计算其线性回归系数r。PS：注意是用浓度对数值进行计算线性回归。8. 复校时间间隔建议不超过1年9. 附录A 标准物质的准备及配制1. 试剂质粒DNA标准物质或核糖核酸标准物质其特性量值（拷贝数≥10^910910^9109copies/μL，相对扩展不确定度≤5 %）满足校准需求，水为符合 GB/T 6682 - 2008 规定的一级水。2. 仪器电子天平，精度≤0.01 mg；移液器，规格：100 μL，1000 μL，且需要通过计量检定。3. 标准物质系列稀释配制将标准物质从 - 20 ℃冰箱中取出，置冰上溶解，然后室温平衡30 min。用经过高温高压灭菌处理的纯水进行稀释配制，并定为阴性对照样本。用电子天平配制系列稀释样品，其中S0位浓度为1×10^910910^9109 copies/μL的标准物质，S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7为S0系列稀释后的样品，每步样品配制后要充分震荡混匀，详细配制方法见下表。来源至国家计量技术规范全文公开系统
4. 未知样品的配制以配制好的S3为起点，用经过校准的天平（0.01 mg）配制未知样品1（U1）和未知样品2（U2），样品配制后要充分震荡混匀，详细配制方法如下表。来源至国家计量技术规范全文公开系统
10. 附录B PCR反应体系的配制1. 试剂ddH20 —— 灭菌双蒸水10 × PCR buffer25 mmol/L MgCl2dNTPs —— 四种脱氧核糖核苷-磷酸混合物10 μmol/L Probe —— 荧光标记探针10 μmol/L Primer 1 —— 引物110 μmol/L Primer 2 —— 引物25 U /μL Taq enzyme —— 热启动酶DNA2. 仪器移液器，规格：2 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL，且需要通过计量检定。3. PCR反应体系的配制参照下表来源至国家计量技术规范全文公开系统
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